పిసిఆర్ ప్రతిచర్యలలో జోక్యం కారకాలు

పిసిఆర్ ప్రతిచర్య సమయంలో, కొన్ని జోక్యం చేసుకునే కారకాలు తరచుగా ఎదురవుతాయి.
పిసిఆర్ యొక్క అధిక సున్నితత్వం కారణంగా, కాలుష్యం పిసిఆర్ ఫలితాలను ప్రభావితం చేసే ముఖ్యమైన కారకాల్లో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది మరియు తప్పుడు సానుకూల ఫలితాలను ఇస్తుంది.
తప్పుడు-ప్రతికూల ఫలితాలకు దారితీసే వివిధ వనరులు కూడా అంతే క్లిష్టమైనవి. పిసిఆర్ మిశ్రమం యొక్క ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ముఖ్యమైన భాగాలు లేదా యాంప్లిఫికేషన్ ప్రతిచర్య కూడా నిరోధించబడితే లేదా జోక్యం చేసుకుంటే, డయాగ్నొస్టిక్ అస్సేకు ఆటంకం ఉంటుంది. ఇది తగ్గిన సామర్థ్యం మరియు తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాలకు దారితీస్తుంది.
నిరోధంతో పాటు, నమూనా తయారీకి ముందు షిప్పింగ్ మరియు/లేదా నిల్వ పరిస్థితుల కారణంగా లక్ష్య న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల సమగ్రత కోల్పోవచ్చు. ప్రత్యేకించి, అధిక ఉష్ణోగ్రతలు లేదా సరిపోని నిల్వ కణాలు మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల నష్టానికి దారితీయవచ్చు. సెల్ మరియు టిష్యూ ఫిక్సేషన్ మరియు పారాఫిన్ ఎంబెడ్డింగ్ DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మరియు నిరంతర సమస్యకు బాగా తెలిసిన కారణాలు (గణాంకాలు 1 మరియు 2 చూడండి). ఈ సందర్భాలలో, సరైన ఒంటరితనం మరియు శుద్దీకరణ కూడా సహాయపడవు.

మూర్తి 1 | DNA సమగ్రతపై స్థిరీకరణ ప్రభావం
అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ శవపరీక్ష యొక్క పారాఫిన్ విభాగాల నుండి వేరుచేయబడిన DNA యొక్క నాణ్యత గణనీయంగా మారుతుందని చూపించింది. ఫిక్సేషన్ పద్ధతిని బట్టి వేర్వేరు సగటు శకలం పొడవు యొక్క DNA సారంలలో ఉంది. స్థానిక స్తంభింపచేసిన నమూనాలలో మరియు బఫర్డ్ న్యూట్రల్ ఫార్మాలిన్లో స్థిరపడినప్పుడు మాత్రమే DNA సంరక్షించబడింది. బలమైన ఆమ్ల బౌయిన్ ఫిక్సేటివ్ లేదా అన్‌బఫర్డ్, ఫార్మిక్ యాసిడ్ కలిగిన ఫార్మాలిన్ వాడకం ఫలితంగా DNA యొక్క గణనీయమైన నష్టం జరిగింది. మిగిలిన భిన్నం చాలా విచ్ఛిన్నమైంది.
ఎడమ వైపున, శకలాలు పొడవు కిలోబేస్ జతలలో (kbp) వ్యక్తీకరించబడుతుంది

మూర్తి 2 | న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల లక్ష్యాల సమగ్రత కోల్పోవడం
(ఎ) రెండు తంతువులపై 3′-5 ′ గ్యాప్ లక్ష్యం DNA లో విరామం ఇస్తుంది. DNA యొక్క సంశ్లేషణ ఇప్పటికీ చిన్న భాగం మీద సంభవిస్తుంది. ఏదేమైనా, DNA శకలాలు ఒక ప్రైమర్ ఎనియలింగ్ సైట్ తప్పిపోతే, సరళ విస్తరణ మాత్రమే జరుగుతుంది. చాలా అనుకూలమైన సందర్భంలో, శకలాలు ఒకదానికొకటి పునరుద్ఘాటించవచ్చు, కాని దిగుబడి చిన్నది మరియు గుర్తించే స్థాయిల క్రింద ఉంటుంది.
. పొడుగుచేసిన వార్మింగ్ దశలో, ప్రైమర్‌లు మ్యాట్రిక్స్ DNA నుండి కరిగిపోతాయి మరియు తక్కువ కఠినమైన పరిస్థితులలో కూడా ఎనియల్ చేయవు.
(సి) ప్రక్కనే ఉన్న థైమిన్ స్థావరాలు టిటి డైమర్‌ను ఏర్పరుస్తాయి.
మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్స్‌లో తరచుగా సంభవించే మరో సాధారణ సమస్య ఫినాల్-క్లోరోఫామ్ వెలికితీతతో పోలిస్తే లక్ష్య న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల కంటే తక్కువ-ఆప్టిమల్ విడుదల. తీవ్రమైన సందర్భాల్లో, ఇది తప్పుడు ప్రతికూలతలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. సెల్ శిధిలాల యొక్క ఉడకబెట్టడం లేదా ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియ ద్వారా ఎక్కువ సమయం ఆదా చేయవచ్చు, అయితే ఈ పద్ధతి తరచుగా తగినంత న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల విడుదల కారణంగా తక్కువ పిసిఆర్ సున్నితత్వానికి దారితీస్తుంది.

విస్తరణ సమయంలో పాలిమరేస్ కార్యాచరణ యొక్క నిరోధం

సాధారణంగా, ఉపశీర్షిక PCR ఫలితాలకు దారితీసే అన్ని అంశాలను వివరించడానికి నిరోధం కంటైనర్ భావనగా ఉపయోగించబడుతుంది. ఖచ్చితంగా జీవరసాయన కోణంలో, నిరోధం ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణకు పరిమితం చేయబడింది, అనగా, ఇది DNA పాలిమరేస్ లేదా దాని కోఫాక్టర్ యొక్క క్రియాశీల సైట్ (ఉదా., TAQ DNA పాలిమరేస్ కోసం MG2+) యొక్క క్రియాశీల సైట్‌తో పరస్పర చర్య ద్వారా ఉపరితల-ఉత్పత్తి మార్పిడిని తగ్గిస్తుంది లేదా నిరోధిస్తుంది.
నమూనా లేదా వివిధ బఫర్‌లు మరియు కారకాలను కలిగి ఉన్న వివిధ బఫర్‌లు మరియు సారం ఎంజైమ్‌ను నేరుగా నిరోధించగలవు లేదా దాని కాఫాక్టర్లను (ఉదా. EDTA) ట్రాప్ చేయగలవు, తద్వారా పాలిమరేస్‌ను నిష్క్రియం చేస్తుంది మరియు తద్వారా తగ్గిన లేదా తప్పుడు ప్రతికూల PCR ఫలితాలకు దారితీస్తుంది.
అయినప్పటికీ, ప్రతిచర్య భాగాలు మరియు లక్ష్యం కలిగిన న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల మధ్య అనేక పరస్పర చర్యలు కూడా 'పిసిఆర్ ఇన్హిబిటర్స్' గా నియమించబడ్డాయి. సెల్ యొక్క సమగ్రత ఒంటరిగా మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం విడుదల అయిన తర్వాత, నమూనా మరియు దాని పరిసర ద్రావణం మరియు ఘన దశ మధ్య పరస్పర చర్యలు సంభవించవచ్చు. ఉదాహరణకు, 'స్కావెంజర్స్' సింగిల్- లేదా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ డిఎన్‌ఎను సమయోజనీయరహిత పరస్పర చర్యల ద్వారా బంధించగలదు మరియు చివరికి పిసిఆర్ ప్రతిచర్య పాత్రకు చేరుకునే లక్ష్యాల సంఖ్యను తగ్గించడం ద్వారా ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణకు ఆటంకం కలిగిస్తుంది.
సాధారణంగా, పిసిఆర్ నిరోధకాలు క్లినికల్ డయాగ్నొస్టిక్ పరీక్షలు (మూత్రంలో యూరియా, హిమోగ్లోబిన్ మరియు రక్తంలో హెపారిన్), ఆహార పదార్ధాలు (సేంద్రీయ భాగాలు, గ్లైకోజెన్, కొవ్వు, సిఎ 2+ అయాన్లు) మరియు పర్యావరణంలో భాగాలు (ఫినోల్స్, హెవీ లోహాలు) కోసం పిసిఆర్ నిరోధకాలు ఉన్నాయి (ఫినోల్స్, హెవీ లోహాలు)

బ్యాక్టీరియా మరియు యూకారియోటిక్ కణాలు, లక్ష్యం కాని DNA, కణజాల మాత్రికల యొక్క DNA- బైండింగ్ స్థూల కణాలు మరియు చేతి తొడుగులు మరియు ప్లాస్టిక్స్ వంటి ప్రయోగశాల పరికరాలలో ఎక్కువ ప్రాబల్య PCR నిరోధకాలు కనుగొనబడతాయి. వెలికితీసేటప్పుడు లేదా తరువాత న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల శుద్దీకరణ PCR నిరోధకాలను తొలగించడానికి ఇష్టపడే పద్ధతి.
ఈ రోజు, వివిధ ఆటోమేటెడ్ వెలికితీత పరికరాలు అనేక మాన్యువల్ ప్రోటోకాల్‌లను భర్తీ చేయగలవు, అయితే 100% రికవరీ మరియు/లేదా లక్ష్యాల శుద్దీకరణ ఎప్పుడూ సాధించబడలేదు. సంభావ్య నిరోధకాలు ఇప్పటికీ శుద్ధి చేయబడిన న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలలో ఉండవచ్చు లేదా ఇప్పటికే అమలులోకి రావచ్చు. నిరోధకాల ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వివిధ వ్యూహాలు ఉన్నాయి. తగిన పాలిమరేస్ యొక్క ఎంపిక నిరోధక చర్యపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. పిసిఆర్ నిరోధాన్ని తగ్గించడానికి ఇతర నిరూపితమైన పద్ధతులు పాలిమరేస్ గా ration తను పెంచుతున్నాయి లేదా BSA వంటి సంకలనాలను వర్తింపజేయడం.
అంతర్గత ప్రక్రియ నాణ్యత నియంత్రణ (ఐపిసి) వాడకం ద్వారా పిసిఆర్ ప్రతిచర్యల నిరోధాన్ని ప్రదర్శించవచ్చు.
వెలికితీత కిట్‌లో ఉన్న అన్ని కారకాలు మరియు ఇతర పరిష్కారాలను తొలగించడానికి జాగ్రత్త తీసుకోవాలి, ఇథనాల్, EDTA, CETAB, LICL, గుస్క్న్, SDS, ఐసోప్రొపనాల్ మరియు ఫినాల్, న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఐసోలేట్ నుండి పూర్తిగా కడగడం దశ ద్వారా. వాటి ఏకాగ్రతను బట్టి, వారు PCR ని సక్రియం చేయవచ్చు లేదా నిరోధించవచ్చు.