PCR ప్రతిచర్యలలో జోక్యం కారకాలు

PCR ప్రతిచర్య సమయంలో, కొన్ని జోక్యం చేసుకునే కారకాలు తరచుగా ఎదురవుతాయి.
PCR యొక్క అధిక సున్నితత్వం కారణంగా, కాలుష్యం PCR ఫలితాలను ప్రభావితం చేసే అతి ముఖ్యమైన కారకాల్లో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది మరియు తప్పుడు సానుకూల ఫలితాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.
తప్పుడు-ప్రతికూల ఫలితాలకు దారితీసే వివిధ వనరులు కూడా అంతే కీలకం. PCR మిశ్రమం యొక్క ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ముఖ్యమైన భాగాలు లేదా యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్ నిరోధించబడితే లేదా జోక్యం చేసుకుంటే, రోగనిర్ధారణ పరీక్షకు ఆటంకం కలుగుతుంది. ఇది సామర్థ్యం తగ్గడానికి మరియు తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాలకు కూడా దారితీస్తుంది.
నిరోధంతో పాటు, నమూనా తయారీకి ముందు షిప్పింగ్ మరియు/లేదా నిల్వ పరిస్థితుల కారణంగా లక్ష్య న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల సమగ్రత కోల్పోవచ్చు. ముఖ్యంగా, అధిక ఉష్ణోగ్రతలు లేదా తగినంత నిల్వ లేకపోవడం వల్ల కణాలు మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలు దెబ్బతినవచ్చు. కణం మరియు కణజాల స్థిరీకరణ మరియు పారాఫిన్ ఎంబెడ్డింగ్ అనేవి DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మరియు నిరంతర సమస్యకు బాగా తెలిసిన కారణాలు (చిత్రాలు 1 మరియు 2 చూడండి). ఈ సందర్భాలలో, సరైన ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణ కూడా సహాయపడవు.

చిత్రం 1 | DNA సమగ్రతపై స్థిరీకరణ ప్రభావం
శవపరీక్షల పారాఫిన్ విభాగాల నుండి వేరుచేయబడిన DNA నాణ్యత గణనీయంగా మారుతుందని అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ చూపించింది. స్థిరీకరణ పద్ధతిని బట్టి వివిధ సగటు భాగాల పొడవు గల DNA సారాలలో ఉంది. స్థానిక ఘనీభవించిన నమూనాలలో మరియు బఫర్డ్ న్యూట్రల్ ఫార్మాలిన్‌లో స్థిరపరచబడినప్పుడు మాత్రమే DNA భద్రపరచబడింది. బలమైన ఆమ్ల బౌయిన్ ఫిక్సేటివ్ లేదా బఫర్ చేయని, ఫార్మిక్ ఆమ్లం కలిగిన ఫార్మాలిన్ వాడకం వలన DNA గణనీయంగా నష్టపోయింది. మిగిలిన భాగం బాగా విచ్ఛిన్నమైంది.
ఎడమ వైపున, భాగాల పొడవు కిలోబేస్ జతలలో (kbp) వ్యక్తీకరించబడింది.

చిత్రం 2 | న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ లక్ష్యాల సమగ్రత కోల్పోవడం
(ఎ) రెండు తంతువులపై 3′-5′ అంతరం లక్ష్య DNAలో విరామం కలిగిస్తుంది. DNA సంశ్లేషణ ఇప్పటికీ చిన్న భాగంపై జరుగుతుంది. అయితే, DNA భాగంలో ప్రైమర్ ఎనియలింగ్ సైట్ లేకుంటే, లీనియర్ యాంప్లిఫికేషన్ మాత్రమే జరుగుతుంది. అత్యంత అనుకూలమైన సందర్భంలో, భాగాలు ఒకదానికొకటి తిరిగి సంతృప్తమవుతాయి, కానీ దిగుబడి తక్కువగా ఉంటుంది మరియు గుర్తింపు స్థాయిల కంటే తక్కువగా ఉంటుంది.
(బి) ప్రధానంగా డీప్యూరినేషన్ మరియు థైమిడిన్ డైమర్ ఏర్పడటం వలన బేస్‌లు కోల్పోవడం వలన H-బంధాల సంఖ్య తగ్గుతుంది మరియు Tm తగ్గుతుంది. పొడిగించబడిన వార్మింగ్ దశలో, ప్రైమర్‌లు మాతృక DNA నుండి కరిగిపోతాయి మరియు తక్కువ కఠినమైన పరిస్థితులలో కూడా ఎనియల్ చేయవు.
(సి) ప్రక్కనే ఉన్న థైమిన్ స్థావరాలు TT డైమర్‌ను ఏర్పరుస్తాయి.
మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్స్‌లో తరచుగా సంభవించే మరో సాధారణ సమస్య ఏమిటంటే, ఫినాల్-క్లోరోఫామ్ వెలికితీతతో పోలిస్తే లక్ష్య న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల విడుదల తక్కువగా ఉండటం. తీవ్రమైన సందర్భాల్లో, ఇది తప్పుడు ప్రతికూలతలతో ముడిపడి ఉంటుంది. మరిగే లైసిస్ లేదా కణ శిధిలాల ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియ ద్వారా చాలా సమయం ఆదా అవుతుంది, కానీ ఈ పద్ధతి తరచుగా తగినంత న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల విడుదల కారణంగా తక్కువ PCR సున్నితత్వానికి దారితీస్తుంది.

విస్తరణ సమయంలో పాలిమరేస్ కార్యకలాపాల నిరోధం

సాధారణంగా, ఉప-ఆప్టిమల్ PCR ఫలితాలకు దారితీసే అన్ని అంశాలను వివరించడానికి నిరోధం ఒక కంటైనర్ భావనగా ఉపయోగించబడుతుంది. ఖచ్చితంగా జీవరసాయన కోణంలో, నిరోధం ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణకు పరిమితం చేయబడింది, అనగా, ఇది DNA పాలిమరేస్ యొక్క క్రియాశీల సైట్ లేదా దాని కోఫాక్టర్‌తో (ఉదా., Taq DNA పాలిమరేస్ కోసం Mg2+) పరస్పర చర్య ద్వారా ఉపరితల-ఉత్పత్తి మార్పిడిని తగ్గిస్తుంది లేదా నిరోధిస్తుంది.
నమూనాలోని భాగాలు లేదా రియాజెంట్‌లను కలిగి ఉన్న వివిధ బఫర్‌లు మరియు ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌లు నేరుగా ఎంజైమ్‌ను నిరోధించగలవు లేదా దాని కోఫాక్టర్‌లను (ఉదా. EDTA) ట్రాప్ చేయగలవు, తద్వారా పాలిమరేస్‌ను నిష్క్రియం చేస్తాయి మరియు ఫలితంగా తగ్గిన లేదా తప్పుడు ప్రతికూల PCR ఫలితాలకు దారితీస్తాయి.
అయితే, ప్రతిచర్య భాగాలు మరియు లక్ష్యాన్ని కలిగి ఉన్న న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల మధ్య అనేక పరస్పర చర్యలను 'PCR నిరోధకాలు' అని కూడా పిలుస్తారు. ఐసోలేషన్ ద్వారా కణం యొక్క సమగ్రత దెబ్బతిని, న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం విడుదల చేయబడిన తర్వాత, నమూనా మరియు దాని చుట్టుపక్కల ద్రావణం మరియు ఘన దశ మధ్య పరస్పర చర్యలు సంభవించవచ్చు. ఉదాహరణకు, 'స్కావెంజర్లు' నాన్-కోవాలెంట్ పరస్పర చర్యల ద్వారా సింగిల్ లేదా డబుల్-స్ట్రాండ్డ్ DNA ని బంధించగలవు మరియు చివరికి PCR ప్రతిచర్య పాత్రను చేరుకునే లక్ష్యాల సంఖ్యను తగ్గించడం ద్వారా ఐసోలేషన్ మరియు శుద్ధీకరణలో జోక్యం చేసుకోగలవు.
సాధారణంగా, PCR నిరోధకాలు చాలా శరీర ద్రవాలు మరియు క్లినికల్ డయాగ్నస్టిక్ పరీక్షలకు ఉపయోగించే కారకాలలో (మూత్రంలో యూరియా, రక్తంలో హిమోగ్లోబిన్ మరియు హెపారిన్), ఆహార పదార్ధాలు (సేంద్రీయ భాగాలు, గ్లైకోజెన్, కొవ్వు, Ca2+ అయాన్లు) మరియు పర్యావరణంలోని భాగాలు (ఫినాల్స్, భారీ లోహాలు) ఉంటాయి.

బ్యాక్టీరియా మరియు యూకారియోటిక్ కణాలు, లక్ష్యం కాని DNA, కణజాల మాత్రికల DNA- బైండింగ్ స్థూల అణువులు మరియు చేతి తొడుగులు మరియు ప్లాస్టిక్‌లు వంటి ప్రయోగశాల పరికరాలలో మరింత ప్రబలంగా ఉన్న PCR నిరోధకాలు కనిపిస్తాయి. PCR నిరోధకాలను తొలగించడానికి న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల శుద్ధీకరణ ప్రాధాన్యతనిచ్చే పద్ధతి.
నేడు, వివిధ ఆటోమేటెడ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ పరికరాలు అనేక మాన్యువల్ ప్రోటోకాల్‌లను భర్తీ చేయగలవు, కానీ 100% రికవరీ మరియు/లేదా లక్ష్యాల శుద్ధీకరణ ఎప్పుడూ సాధించబడలేదు. శుద్ధి చేయబడిన న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలలో సంభావ్య నిరోధకాలు ఇప్పటికీ ఉండవచ్చు లేదా ఇప్పటికే ప్రభావం చూపి ఉండవచ్చు. నిరోధకాల ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వివిధ వ్యూహాలు ఉన్నాయి. తగిన పాలిమరేస్ ఎంపిక నిరోధక కార్యకలాపాలపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. PCR నిరోధాన్ని తగ్గించడానికి ఇతర నిరూపితమైన పద్ధతులు పాలిమరేస్ సాంద్రతను పెంచడం లేదా BSA వంటి సంకలితాలను వర్తింపజేయడం.
అంతర్గత ప్రక్రియ నాణ్యత నియంత్రణ (IPC) ఉపయోగించడం ద్వారా PCR ప్రతిచర్యల నిరోధాన్ని ప్రదర్శించవచ్చు.
న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఐసోలేట్ నుండి ఇథనాల్, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ఐసోప్రొపనాల్ మరియు ఫినాల్ వంటి ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ కిట్‌లోని అన్ని రియాజెంట్‌లను మరియు ఇతర ద్రావణాలను పూర్తిగా కడగడం ద్వారా తొలగించడానికి జాగ్రత్త తీసుకోవాలి. వాటి ఏకాగ్రతను బట్టి, అవి PCRని సక్రియం చేయవచ్చు లేదా నిరోధించవచ్చు.