PCR ప్రతిచర్యలలో జోక్యం కారకాలు

PCR ప్రతిచర్య సమయంలో, కొన్ని అంతరాయం కలిగించే కారకాలు తరచుగా ఎదురవుతాయి.
PCR యొక్క అధిక సున్నితత్వం కారణంగా, PCR ఫలితాలను ప్రభావితం చేసే అత్యంత ముఖ్యమైన కారకాల్లో కాలుష్యం ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది మరియు తప్పుడు సానుకూల ఫలితాలను అందించవచ్చు.
తప్పుడు-ప్రతికూల ఫలితాలకు దారితీసే వివిధ మూలాధారాలు కూడా అంతే క్లిష్టమైనవి. PCR మిశ్రమం యొక్క ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ముఖ్యమైన భాగాలు లేదా యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్ నిరోధించబడితే లేదా అంతరాయం కలిగితే, రోగనిర్ధారణ పరీక్షకు ఆటంకం ఏర్పడుతుంది. ఇది సామర్థ్యం తగ్గడానికి మరియు తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాలకు కూడా దారి తీస్తుంది.
నిరోధానికి అదనంగా, నమూనా తయారీకి ముందు షిప్పింగ్ మరియు/లేదా నిల్వ పరిస్థితుల కారణంగా టార్గెట్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సమగ్రత కోల్పోవచ్చు. ప్రత్యేకించి, అధిక ఉష్ణోగ్రతలు లేదా సరిపోని నిల్వ కణాలు మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల నష్టానికి దారితీయవచ్చు. సెల్ మరియు టిష్యూ ఫిక్సేషన్ మరియు పారాఫిన్ ఎంబెడ్డింగ్ DNA ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మరియు నిరంతర సమస్యకు బాగా తెలిసిన కారణాలు (గణాంకాలు 1 మరియు 2 చూడండి). ఈ సందర్భాలలో, సరైన ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణ కూడా సహాయం చేయదు.

మూర్తి 1 | DNA సమగ్రతపై స్థిరీకరణ ప్రభావం
అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ శవపరీక్షల యొక్క పారాఫిన్ విభాగాల నుండి వేరుచేయబడిన DNA యొక్క నాణ్యత గణనీయంగా మారుతుందని చూపించింది. ఫిక్సేషన్ పద్ధతిని బట్టి ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌లలో వేర్వేరు సగటు శకలాల పొడవుల DNA ఉంది. స్థానిక స్తంభింపచేసిన నమూనాలలో మరియు బఫర్ చేయబడిన తటస్థ ఫార్మాలిన్‌లో స్థిరంగా ఉన్నప్పుడు మాత్రమే DNA భద్రపరచబడుతుంది. బలమైన ఆమ్ల బౌయిన్ ఫిక్సేటివ్ లేదా అన్‌బఫర్డ్, ఫార్మిక్ యాసిడ్-కలిగిన ఫార్మాలిన్‌ను ఉపయోగించడం వలన DNA గణనీయమైన నష్టానికి దారితీసింది. మిగిలిన భాగం చాలా విచ్ఛిన్నమైంది.
ఎడమ వైపున, శకలాల పొడవు కిలోబేస్ జతలలో వ్యక్తీకరించబడింది (kbp)

మూర్తి 2 | న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ లక్ష్యాల సమగ్రతను కోల్పోవడం
(ఎ) రెండు తంతువులపై 3′-5′ గ్యాప్ లక్ష్యం DNAలో విచ్ఛిన్నానికి దారి తీస్తుంది. DNA యొక్క సంశ్లేషణ ఇప్పటికీ చిన్న భాగంపై జరుగుతుంది. అయినప్పటికీ, DNA ఫ్రాగ్‌మెంట్‌లో ప్రైమర్ ఎనియలింగ్ సైట్ తప్పిపోయినట్లయితే, లీనియర్ యాంప్లిఫికేషన్ మాత్రమే జరుగుతుంది. అత్యంత అనుకూలమైన సందర్భంలో, శకలాలు ఒకదానికొకటి పూరించవచ్చు, కానీ దిగుబడి తక్కువగా ఉంటుంది మరియు గుర్తించే స్థాయి కంటే తక్కువగా ఉంటుంది.
(బి) ప్రధానంగా డీప్యూరినేషన్ మరియు థైమిడిన్ డైమర్ ఏర్పడటం వల్ల స్థావరాల నష్టం, H-బాండ్ల సంఖ్య తగ్గడానికి మరియు Tm తగ్గడానికి దారితీస్తుంది. పొడుగుచేసిన వేడెక్కుతున్న దశలో, ప్రైమర్‌లు మాతృక DNA నుండి దూరంగా కరిగిపోతాయి మరియు తక్కువ కఠినమైన పరిస్థితుల్లో కూడా వినాశనం చెందవు.
(సి) ప్రక్కనే ఉన్న థైమిన్ స్థావరాలు TT డైమర్‌ను ఏర్పరుస్తాయి.
మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్స్‌లో తరచుగా సంభవించే మరో సాధారణ సమస్య ఫినాల్-క్లోరోఫామ్ వెలికితీతతో పోలిస్తే టార్గెట్ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల యొక్క సరైన విడుదల కంటే తక్కువ. తీవ్రమైన సందర్భాల్లో, ఇది తప్పుడు ప్రతికూలతలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. కణ శిధిలాలను ఉడకబెట్టడం లేదా ఎంజైమాటిక్ జీర్ణక్రియ ద్వారా చాలా సమయం ఆదా అవుతుంది, అయితే ఈ పద్ధతి తరచుగా న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ విడుదల తగినంతగా లేకపోవడం వల్ల తక్కువ PCR సున్నితత్వాన్ని కలిగిస్తుంది.

విస్తరణ సమయంలో పాలిమరేస్ కార్యకలాపాల నిరోధం

సాధారణంగా, ఉపశీర్షిక PCR ఫలితాలకు దారితీసే అన్ని అంశాలను వివరించడానికి నిరోధం ఒక కంటైనర్ కాన్సెప్ట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది. ఖచ్చితమైన జీవరసాయన కోణంలో, నిరోధం అనేది ఎంజైమ్ యొక్క కార్యకలాపానికి పరిమితం చేయబడింది, అనగా, DNA పాలిమరేస్ లేదా దాని కోఫాక్టర్ (ఉదా, Taq DNA పాలిమరేస్ కోసం Mg2+) యొక్క క్రియాశీల సైట్‌తో పరస్పర చర్య ద్వారా సబ్‌స్ట్రేట్-ఉత్పత్తి మార్పిడిని తగ్గిస్తుంది లేదా నిరోధిస్తుంది.
నమూనాలోని భాగాలు లేదా వివిధ బఫర్‌లు మరియు రియాజెంట్‌లను కలిగి ఉన్న ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌లు నేరుగా ఎంజైమ్‌ను నిరోధిస్తాయి లేదా దాని కాఫాక్టర్‌లను (ఉదా. EDTA) ట్రాప్ చేస్తాయి, తద్వారా పాలిమరేస్‌ను నిష్క్రియం చేస్తుంది మరియు క్రమంగా తగ్గిన లేదా తప్పుడు ప్రతికూల PCR ఫలితాలకు దారితీస్తుంది.
అయినప్పటికీ, ప్రతిచర్య భాగాలు మరియు లక్ష్యం-కలిగిన న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల మధ్య అనేక పరస్పర చర్యలు కూడా 'PCR ఇన్హిబిటర్స్'గా పేర్కొనబడ్డాయి. కణం యొక్క సమగ్రతను వేరుచేయడం మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం విడుదల చేసిన తర్వాత, నమూనా మరియు దాని చుట్టుపక్కల పరిష్కారం మరియు ఘన దశ మధ్య పరస్పర చర్యలు సంభవించవచ్చు. ఉదాహరణకు, 'స్కావెంజర్లు' నాన్-కోవాలెంట్ ఇంటరాక్షన్‌ల ద్వారా సింగిల్ లేదా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAని బంధించవచ్చు మరియు చివరికి PCR ప్రతిచర్య నౌకను చేరుకునే లక్ష్యాల సంఖ్యను తగ్గించడం ద్వారా ఐసోలేషన్ మరియు శుద్దీకరణలో జోక్యం చేసుకోవచ్చు.
సాధారణంగా, PCR ఇన్హిబిటర్లు చాలా శరీర ద్రవాలలో ఉంటాయి మరియు క్లినికల్ డయాగ్నస్టిక్ పరీక్షలకు (మూత్రంలో యూరియా, హిమోగ్లోబిన్ మరియు రక్తంలో హెపారిన్), ఆహార పదార్ధాలు (సేంద్రీయ భాగాలు, గ్లైకోజెన్, కొవ్వు, Ca2+ అయాన్లు) మరియు పర్యావరణంలోని భాగాలు (ఫినాల్స్) కోసం ఉపయోగిస్తారు. , భారీ లోహాలు)

మరింత ప్రబలంగా ఉన్న PCR ఇన్హిబిటర్లు బ్యాక్టీరియా మరియు యూకారియోటిక్ కణాలు, లక్ష్యం కాని DNA, కణజాల మాత్రికల DNA-బైండింగ్ స్థూల కణాలు మరియు చేతి తొడుగులు మరియు ప్లాస్టిక్‌లు వంటి ప్రయోగశాల పరికరాలలో కనుగొనవచ్చు. పిసిఆర్ ఇన్హిబిటర్లను తొలగించడానికి న్యూక్లియిక్ యాసిడ్‌లను వెలికితీసే సమయంలో లేదా తర్వాత శుద్ధి చేయడం ప్రాధాన్య పద్ధతి.
నేడు, వివిధ స్వయంచాలక వెలికితీత పరికరాలు అనేక మాన్యువల్ ప్రోటోకాల్‌లను భర్తీ చేయగలవు, అయితే 100% రికవరీ మరియు/లేదా లక్ష్యాల శుద్ధీకరణ ఎప్పుడూ సాధించబడలేదు. శుద్ధి చేయబడిన న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలలో సంభావ్య నిరోధకాలు ఇప్పటికీ ఉండవచ్చు లేదా ఇప్పటికే ప్రభావం చూపి ఉండవచ్చు. నిరోధకాల ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి వివిధ వ్యూహాలు ఉన్నాయి. తగిన పాలిమరేస్ ఎంపిక నిరోధక చర్యపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. PCR నిరోధాన్ని తగ్గించడానికి ఇతర నిరూపితమైన పద్ధతులు పాలిమరేస్ ఏకాగ్రతను పెంచడం లేదా BSA వంటి సంకలితాలను వర్తింపజేయడం.
అంతర్గత ప్రక్రియ నాణ్యత నియంత్రణ (IPC) ఉపయోగించడం ద్వారా PCR ప్రతిచర్యల నిరోధం ప్రదర్శించబడుతుంది.
న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఐసోలేట్ నుండి ఇథనాల్, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ఐసోప్రొపనాల్ మరియు ఫినాల్ వంటి ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ కిట్‌లోని అన్ని రియాజెంట్‌లు మరియు ఇతర సొల్యూషన్‌లను పూర్తిగా కడగడం ద్వారా తొలగించడానికి జాగ్రత్త తీసుకోవాలి. వారి ఏకాగ్రతపై ఆధారపడి, వారు PCRని సక్రియం చేయవచ్చు లేదా నిరోధించవచ్చు.